上海、济南生物发酵展
膜醭毕赤酵母
此外，外源基因碱基A+T的含量也是影响外源蛋白表达的一个主要因素。研究显示，A +T含量达到30% ~50%时，最适合外源基因的表达。比如在研究毕赤酵母表达系统中表达嗜热木聚酶时，通过降低A+T的含量使外源基因表达提高了2.8倍。
(1) 培养基成分的影响
近年来氮源优化已经成为研究热点，大多学者多采用恒定或变梯度氨离子浓度法来进行优化。例如研究者在诱导表达S—腺苷基甲硫氨酸（SAM）时，维持NH4+浓度在 8.1g/L 条件下时，外源蛋白的表达量可达到最高，同时发酵时间也缩短了43h。因此优化发酵培养基中的组分在满足细胞旺盛生长的同时还能够实现目的产物的高效表达。
(2) pH 的影响
在毕赤酵母发酵过程中，菌体代谢会产生大量的乙酸、乳酸等，由于这些产物的不断累积，会引起发酵机制 pH 的改变。pH 的变化会导致菌体内H+、OH- 的浓度改变，对菌体的生长、目的蛋白的表达和活性等都有非常显著的影响。毕赤酵母细胞能够适应比较宽泛的pH环境，可以在pH 2.0 ~7.5 生长。不同的蛋白质适应的pH范围不同，而且不同的重组蛋白对不同的蛋白酶的耐受性也有差异，选择适当的pH能够在促进细胞生长的同时避免蛋白酶的活性降低，还可以防止目的蛋白的降解。据报道，许多国内外学者利用响应面分析法、正交设计等对 pH 的条件进行条件优化，从而确定生长期和诱导期的pH。在工业生产中一般多采用在线补加氨水的方法来调节培养基中的pH，氨水可以作为发酵过程中的氮源，使菌体快速生长，最终让目的产物表达完全。此外培养基中通过加入考马酸、EDTA、YP 等成分控制pH还可以提高分泌蛋白的稳定性。
(3) 溶氧量的影响
毕赤酵母是好氧微生物，它的生长代谢都需要氧气的参与，溶氧量（dissolved oxygen content，DO）是酵母细胞生长过程中最重要的检测指标之一，它直接影响着酵母细胞的生长和代谢。在高密度发酵的过程中，保证氧气的足够供给是提高外源蛋白表达量的重要因素。DO 逐渐下降表明菌体正在消耗培养基中的碳源，DO 陡然上升表明碳源耗尽，菌体缺乏营养物质，需要及时补加碳源。当氧气不足时，菌体的生长就会受到抑制，当 DO 过高时，发酵液中高浓度的氧自由基就会使菌体中毒死亡。发酵过程中 DO 一般控制在30%左右，而在诱导表达阶段，DO 一般维持在 20% 左右。通常通过增大搅拌转速、增大通气量及增大罐压来满足菌体对氧的需求，还可以通过调整补料策略来控制溶氧，有时甚至直接通入纯氧来增加溶氧量。
(4) 补料流加策略的影响
甲醇作为发酵过程中的碳源和诱导剂，它的补加策略、用量及诱导时间都直接影响菌体的生长与外源蛋白的表达。一般认为，甲醇的最终浓度为培养基总体积的0.5%~1%，并且对诱导时间也有一定的要求，根据载体的特点及外源蛋白的特性来选择的诱导时间。国内外近年来的研究显示，甲醇的流加策略主要有在线和离线甲醇监控仪器来控制甲醇的流加、溶氧控制甲醇的流加、恒定甲醇浓度流加、指数流加方式控制甲醇的流加、碳源混合流加等。
离线检测包括气象色谱法、高效液相色谱法等，由于其检测的滞后性无法准确的控制甲醇的流加速率，从而导致外源蛋白表达不完全或菌体中毒死亡。在线检测法通常是针对甲醇挥发性的检测，常用的检测方法是通过分析发酵过程中所排出的尾气，同时结合甲醇在气液两相中的平衡系数得出发酵液中甲醇的浓度，有学者发明了一种自动化连续诊断分析方法作为在线控制甲醇浓度的方法，该方法比尾气检测系统更加实用。火焰离子检测器属于多用检测器，既可以离线检测发酵培养液中甲醇的浓度，还可以在线监测发酵液中甲醇浓度的变化。
b. 溶氧控制甲醇流加
溶氧控制甲醇流加速率是目前最常见的方法，利用溶氧电极作为反馈指标，根据 DO 值可自动调节甲醇的流加速率。首先使DO 维持在预先设定值，通常为15%~20%，通过 DO 的变化对甲醇的流加速率进行调整，这样不但能提高甲醇的利用效率还可以避免甲醇浓度过高而造成的毒害作用。然而在毕赤酵母发酵过程中，用溶氧来控制甲醇的流加并不是一种有效的方法，实验表明，当甲醇的浓度达到抑制菌体生长时，DO 上升，从而形成一种假象，这时甲醇的流加速率会随着 DO 的上升而逐渐增大，因此甲醇的浓度也会增大，这样会严重的抑制菌体生长，造成中毒现象。
c. 指数流加方式控制甲醇的流加
指数流加方式是指通过物料守恒方程来调整补料的流加速率，用来维持一定的比生长速率。此方法不需要任何参数，只需要简单的细胞生长模型，蛋白质的生产直接或间接与细胞的生长相关联，所以维持一定的比生长速率有利于强化过程并且能够促进对生长偶联型外源蛋白生产的系统研究。指数流加控制属于开环控制，其操作过程是非线性的，主要通过渐进拟合的方式进行操作，所以其过程中很难实现稳定性和鲁棒性，开始诱导时如果条件发生改变可能会导致甲醇的积累，所以最初的比生长速率设定值低于比生长速率，这也降低了生产能力。
d. 恒定甲醇浓度流加
恒定甲醇浓度补料流加是通过在线甲醇检测装置来控制的，在诱导过程中实时对发酵液中甲醇的浓度进行监测，反馈给外部关联装置而控制甲醇的流加速率，从而维持发酵液中甲醇的浓度恒定。现在市场上销售的甲醇电极就是检测装置之一，但由于其数据漂移及响应滞后的缺点，并未被广泛使用。
e. 碳源混合流加
在毕赤酵母的发酵过程中，甲醇不仅是诱导剂还充当了碳源，大部分甲醇用来维系细胞的正常生长，却无法实现外源蛋白的高效表达，如果加入另外一种碳源，不仅可以减轻甲醇的负荷，还可以减少底物的消耗，避免高耗氧、高产热的现象。因此，目前许多研究者多采用双碳源交替流加的方式来刺激外源蛋白的高效表达，利用混合碳源诱导既能够提高供应给细胞的能量又可以加快毕赤酵母细胞的生长速率。近年来的研究表明，在毕赤酵母高密度发酵时，多采用山梨醇和甲醇混合流加的策略，由于山梨醇对AOX 转录的抑制作用比较弱，并且还能够减缓目的蛋白的胞外降解及降低毒副产物的积累。山梨醇和甲醇混合流加的策略不但可以增加细胞密度、缩短诱导时间，还能提高外源蛋白的表达量，山梨醇目前已经逐渐成为毕赤酵母发酵过程中常用的辅助碳源。实验证明在高密度β-甘露聚糖酶时采用山梨醇和甲醇混合流加的策略进行诱导，实现β-甘露聚糖酶最高产量为 6336U/ml。
随着现代分析技术的进步，毕赤酵母表达系统在合成生物学、分泌工程、生物制药、发酵工程等方面势必扮演着越来越重要的角色，随着毕赤酵母表达机制和发酵过程研究的进一步深入，该表达系统外源蛋白的能力将会显著提高，从而有利于推动大规模发酵生产各种生物制剂、酶制剂等，这将会是科研人员的研究热点。
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内容由生物发酵展组委会周彬131671441215发布！
