【生物发酵展资讯】发酵工艺：凝结芽孢杆菌的高密度发酵及应用

2.1.1 菌株

凝结芽孢杆菌（Bacillus  coagulans）。

2.1.2 培养基

（1）斜面培养基（g/L）：蛋白胨 20，酵母浸粉 10，葡萄糖 20，琼脂 15。

（2）种子培养基（g/L）：蛋白胨 20，酵母浸粉 10，葡萄糖 20。

2.1.3 主要试剂

葡萄糖、胰蛋白胨、氯化钠、酵母浸粉、可溶性淀粉、硫酸铵、磷酸氢二钾、溴甲酚紫、碳酸钙、革兰氏染色试剂盒、芽孢染色试剂盒、细菌DNA提取试剂盒。

2.1.4 主要仪器与设备

净化工作台、电子分析天平、恒温培养振荡器、立式压力蒸汽灭菌器、离心机。

2.2.1 种子培养

（1）甘油管：200μL菌液，-80 ℃冰箱保藏；

（2）一级种子培养基：葡萄糖2%，酵母粉1%，胰蛋白胨2%，pH 6.6。装液量：100 ml/300 ml三角瓶，115 ℃，灭菌20 min；

（3）二级种子培养基：葡萄糖2%，酵母粉1%，胰蛋白胨2%，pH 6.6。装液量：50 ml./250 ml三角瓶，115℃，灭菌20 min；

（4）取一支甘油管接种至一级种子培养基，180 rpm/min，45℃活化培养 24 h；

（5）按照2%接种量将一级种子接种于六瓶二级种子中。

2.2.2 发酵罐培养基

（1）底水：10 L，4.5%蔗糖，1%蛋白胨，1%酵母浸粉，0.03%硫酸锰，0.17%氯化钙，初始发酵 pH 5.0。

（2）流加C源：离心处理的糖浆（50%）3 L，115℃灭菌 30 min。

（3）流加N、P源：蛋白胨250 g，酵母浸粉250 g，用自来水溶解定容至3 L，装入3 L补料瓶，115 ℃灭菌 30 min。

（4）流加碱：称取80g NaOH溶于1 L的自来水，115 ℃灭菌 20 min。

整个发酵过程控制溶氧在10%，最低搅拌转速180 rpm/min，当培养基溶氧降至 10%，提高转速以增加溶氧，放罐总体积约17 L。

2.2.3 发酵罐培养

阶段：将种子液按2%接种量接入装有10 L底水的发酵罐，发酵培养 16 h；

第二阶段：进行 C、N、P源的流加，速率为150 mL/h，发酵培养20 h；

第三阶段：停止流加 C、N、P 源，继续发酵6h；

整个发酵过程，培养温度55℃，控制pH在5.0，溶氧不低于10%，每4 h取一次样。

凝结芽孢杆菌是最有发展前途的产芽孢和乳酸的菌种之一。凝结芽孢杆菌可以抑制肠道致病菌，维持肠道菌群的相对平衡，对营养物质的吸收、肠道疾病的预防等都具有相当好的功效，且因为其可以耐酸的特性，在动物消化系统中可以稳定存在。凝结芽孢杆菌可以促进动物肠道中乳酸菌、双歧杆菌等益生菌的生长，并且能够抑制大肠杆菌等有害菌。

凝结芽孢杆菌在医药方面的应用，包括刺激免疫系统、预防腹泻病、治疗呼吸道感染、降低胆固醇和抗癌作用等。凝结芽孢杆菌还具有分泌多种消化酶的能力，其在医疗中的应用还具有很大的研究空间。

人类肠道中有400多种细菌，这些微生物的平衡对正常的胃肠功能很重要。那么将凝结芽孢杆菌制成微生物机制能够提供肠道屏障、恢复肠道菌群和其他潜在的作用机制。凝结芽孢杆菌可以维持肠道菌群平衡，对妊娠不同时期孕妇、幼儿的肠道腹泻、便秘、腹胀等疾病具有良好的预防作用。

近年来，从电镀、镍镉电池、钢铁制造等行业释放出来的重金属正在对环境和人们的健康造成巨大威胁。在重金属中，铜、镍和铅等金属排放最为频繁。芽孢杆菌，已经被公认为去除有毒金属的材料。然而，由于常规的细菌应用存在一定的缺陷。因此，需要将微生物固定在某种聚合物基质上来解决这一问题。微生物固定化细胞成功地运用在了生活和工业的废水处理上。海藻酸钠、壳聚糖、甲壳素等天然高分子材料因其高效、廉价、无毒等优点被广泛用作固定化基质。

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