上海、济南生物发酵展
我们通常用的优化微生物培养基的方法是采取单因素，多因素等手段选择合适的碳源，氮源，碳氮比等参数。属于暗箱操作，我们直接跨过了去了解微生物对营养物质的需求，而直接通过营养物质和表型的关系，来获得较优的培养基组成，当然这是非常有效的一种手段。但是我们需要对微生物生产对营养物质的需求有更多的了解，接下来给大家介绍一篇通过代谢组学的方法来优化培养基的思路，供大家参考。
一、文章目的
以毕赤酵母生物量为考核指标，以期通过培养基优化，寻找无机盐培养基(BSM，D’Anjou，,Stratton共三种文献报道的用于毕赤酵母工业化生产的无机盐培养基，其特征是培养基由无机盐和微量元素组成，碳源为甘油，碳源为氨水和硫酸铵，因此在摇瓶中，菌体培养效果远远低于BMGY))和复合培养基（BMGY）之间的营养差异，通过代谢组学的方法，弥补该差异，从而获得改良的无机盐培养基。
二、文章主要实验内容
1. 无机盐培养基和复合培养基对菌体生长的影响
野生菌株在BSM中的生长速度低于在BMGY中的生长速度，比生长速率分别为0.187h-1和0.247h-1。并且这种差异并不是由于pH值的差异导致的。在BSM培养基中加入蛋白胨，酵母粉和YNB，也仅仅能将比生长速率提高到0.203h-1。这就表明在BSM培养基中有某种营养成分是过量的，从而不利于菌体的生长。BSM培养基是为了在发酵罐中获得毕赤酵母高密度发酵而设计的，并不适应小规模的应用。
在BSM中甘油提供碳源，已经有实验证明4%以下的甘油浓度不会对毕赤酵母的生长产生影响。氮源由氨水提供，磷和硫由硫酸盐和磷酸盐提供。为了验证上述论证，设置了三组实验，分别将氨水，硫酸盐和磷酸盐减少50%，为了维持pH值的稳定性，分别用氢氧化钾（减少氮源）和氢氧化铵调节PH（减少磷）。由下图可看出，减少硫元素，生物量大大降低，减少氮源氨水的含量，则可以使得生物量有些许提高。
进一步研究表明当氨水浓度大于50mM时氨水浓度和菌体生长成速率成负相关，因此有必要控制氨水浓度，见下图。但是即便我们将氨水浓度降低到25mM，菌体生长速率和BMGY也存在较大的差异。
进一步我们将FM22培养基和Anjou 培养基也作为我们的考察范围之内，两者的无机盐含量整体上比BSM培养基低很多。有研究表面，酿酒酵母在无机盐培养基上生长需要更多的能量。分别设置BSM、FM22和Anjou和培养基的氨水浓度为25mM，用氢氧化钾调节pH到6.5。结果显示具有更低无机盐浓度的Anjou的培养基获得了更高的比生长速率，这说明整体无机盐浓度（渗透压）对毕赤酵母的生长也是不利的。因此选择d’Anjou无机盐培养基开展进一步优化。
在Anjou的基础上，增加酵母粉，蛋白胨和YNB，可以使得比生长速率提高到0.251h-1接近于BMGY中的比生长速率。表明，Anjou培养基和BMGY培养基之间的差异主要在于缺少某些中间代谢产物。
因此，进一步我们优化营养补充剂，以弥补基础盐培养基和BMGY之间的差异。
2.酵母粉和蛋白胨中的关键营养因子
（1）氨基酸的优化
已经有研究表明氨基酸可以提高外源蛋白的表达水平，而氨基酸也可以替代氨水作为氮源。我们首先分析蛋白胨中的氨基酸组成，以减少筛查范围。
根据蛋白胨氨基酸的组成，选择精氨酸，丙氨酸、赖氨酸以及谷氨酰胺进行下一步的研究。其中谷氨酰胺经常用于细胞培养中，所以也在考虑范围之内。数据表明，谷氨酰胺可以显著提高比生长速率，谷氨酰胺是众多氨基酸的前提物质。精氨酸也能显著提高比生长速率。
（2）酵母提取物中的有效物质
酵母提取物中的碳源之前已经被表征过，分别为乳糖和海藻糖，在复合培养基中最终的浓度分别为10mM和5mM。此外酵母提取物中还含有维生素和核苷酸。实验表明，维生素可以显著提高菌体的生长速率，核苷对生长没有什么影响，海藻糖对生长没有明显影响，乳糖明显抑制生长。
(3)优化获得代培养基并评估
经过筛选，我们最终确定了50mM的铵离子，5mM谷氨酰胺、5mM精氨酸和维生素溶液组成的第1代培养基。进一步我们对该培养基进行了评估(下图中黄色曲线)。
由结果可以看出，代培养基的比生长速率接近BMGY的，高于BSM和Anjou培养基，但是总生物量还是有差异。由结果可以看出，在发酵培养24h后，甘油消耗完全，限制了代培养基的生长，但是BMGY由于有其他替代碳源可以继续维持生长，因此可以获得较高的生物量。另外pH值的变化可能也对生物量较低低，产生了影响（这种影响可以在发酵罐中弥补）。另外我们监测了发酵过程中氮源的变化，其中铵的含量在24h时消耗了大部分，但是并未降低到0，说明氮源供给是充足的。而氨基酸含量在8h时就消耗完全，不能满足需要，因此有必要提高起始浓度。
（4）在代培养基中的转录组学研究
我们分别对酵母菌体在BMGY，Anjou培养基和新一代培养基中的代谢组进行了表征，以研究由于培养基的影响带来的代谢变化。总体基因水平在三种培养基中相似度很高，但是个别基因有明显的差异。
Anjou培养基和BMGY之间有112个基因表达差异较大，而新一代培养基和BMGY之间的这种差异仅有67个。结果表明新一代培养基和BMGY之间的差异仍然并未完全弥补。
Anjou培养基和BMGY之间，差异较大的基因为INO1, THI13, THI20, THI4, SNZ2, and THI6，这些基因都和维生素的合成相关，并且在Anjou培养基中上调，这说明其维生素的缺乏。这和我们之前的实验结果相吻合（添加维生素对生长有利）
新一代培养基和BMGY相比，ARO10是BMGY培养基中主要的上调基因，POX1, CAR1, POT1, and GDH3是新一代培养基中主要的上调基因。除CAR1基因外，在Anjou培养基中，这些基因也上调。ARO10和氨基酸的分解代谢相关，BMGY培养基中的上调可能意味着BMGY中存在着可以被利用的肽。POX1 和 POT1和脂肪酸代谢有关，CAR1和精氨酸代谢有关。GDH3和谷氨酸合成和代谢有关，该基因的上调可能是由于培养基中缺少相应氨基酸导致的。因而增加相应的氨基酸和脂肪酸可能提高菌体生长。这些差异基因的差异表达值小于Anjou培养基和BMGY培养基基因的值，这表明他们并不是很重要。实验表明，在培养基中加入脂肪酸和提高氨基酸有利于细胞增殖。
进一步作者通过将转录组数据映射到基因组规模的代谢网络中，并使用报告代谢物算法来识别表达变化集中的代谢物，从而来确定备选培养基成分。首先作者通过已知的维生素因素验证了该模型的准确性（已经实验证明生物素的有效性）。通过该模型分析，确定了脂肪酸的重要性，另外肌醇和烟酸也很重要。
（5）最终培养基
因此在代谢组学分析的基础上，通过加入 7种脂肪酸，胆固醇和一些表面活性剂，并将谷氨酰胺和精氨酸加倍，形成新的培养基，将该培养基命名为RDM，RDM的比生长速率略有增加，当我们对RDM中生长的细胞进行测序时，我们发现与辅酶A相连的脂肪酸酰基不再是显著的报告代谢物，证实了脂肪酸被代谢。RDM和BMGY之间其余的差异表达基因主要反映了氨基酸组成的差异，如上述ARO10和GDH3。通过对RDM培养基中外源表达基因的评估，表明该培养基对外源基因的表达也是有利的。
参考文献：
Catherine B. Matthews,Angel Kuo,Development of a general defined medium for Pichia pastoris
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