干货|可靠的pH控制提高生物反应器自动化和细胞生产力

随着生物加工技术的应用不断进步和蛋白类治疗分子复杂性的增加，过程分析技术（Process Analytical Technology，PAT）测量工具正在不断地跟上实际应用的步伐。数据需求也发生了变化，可靠且有意义的数据对于理解生物制造过程和实施过程控制变得越来越重要。然而，当前问题的焦点仍然是传感器或探头的可用性是否足已满足这些不断变化的需求。

生物反应器需要传感器或探头来收集生物过程中的关键数据，尤其是有关pH、溶氧(DO)和细胞活力的数据。然而，生物制药行业仍然需要不断改进的传感器技术。所需要的具体改进包括：具有低限检测阈值的高分辨率传感器、在单批生产过程中无需重复校准的高频测量工艺参数的能力，以及在线表征蛋白质的能力。以可靠、可重复和稳定的方式以及高精度构建生产用生物反应器。

传感器对于生物制品制造中PAT实施有何重要性？

传感器是PAT实施的核心。PAT本质上是不断测量尽可能多的过程参数，以最深入地了解生产工艺过程。传感器是用于获得这些测量值的工具，可为工艺控制提供更多参数、更多数据。许多传感器的测量信息实时用于自动化过程控制（如实时的pH、溶氧测量），这些数据也可用于过程监控甚至后处理计算。同时对于故障排除、优化或在需要实时确定监测参数的用途非常重要。在生物反应器上拥有更多传感器来收集尽可能多的过程信息，与工具箱中拥有更多工具是一样的道理。在过去十年当中，用于测量pH与其他参数的数字过程分析测量系统。

传感器需要适应生物制药使用的需求。传感器的开发需要保持其可重复使用的稳定性和度。特别是在使用传感器的设施中尤其如此。除了满足可重复使用的期望外，传感器还需要能够集成到一次性反应袋或反应器中，并满足这些设备部件的要求。这就意味着传感器能够承受高温湿热消毒、长时间的储存，并且需要长时间保持不泄漏电解液。所有这些要求都确保传感器的准确性和可靠性不会发生实质性变化。

生物反应器中传感器的需求 

生物制药上游一直依赖过程测量，因为必须密切监测营养物质水平和过程参数，以确保细胞培养的细胞总量、活力和培养过程的稳定。然而，多年来，将这种方法扩展到真正的过程分析技术(PAT)并使用它来跟踪和控制工艺过程主要是在临床前研究实验室中（指临床前研究）完成的。近来，生物行业内发生了重大的观念转变。生物制药企业开始在更高级的新药开发甚至一些生产制造工作中使用PAT，同时这种理念也在向下游转移。正如我们所看到的，生物制药公司现在正在将PAT和先进过程控制技术应用于制造领域的各个方面。正如大家所意识到的“PAT不仅仅是将探头或传感器插入生物反应器。要使先进的过程监测和控制方法可行，需要做大量的工作。”在这一点上，由于单元操作和生产基础设施的复杂性更高，生物制药仍然落后于小分子制造（这些传感器通常用于GMP设施）。

传感器对于实现PAT非常重要。使用适合的传感器对于不锈钢或玻璃反应器的工艺过程理解至关重要。使用可靠的传感器有很多可能的问题是可以避免的。可靠的传感器可确保针对集成类型参数测量的优化。传感器的实施使人们能够提高对过程的理解程度。许多可用于反应器的传感器（尤其是智能和数字传感器）已被证明可以提供可靠和稳定的数据。当传感器专为反应器应用而开发，并具有多次可重复使用的优点时，可以获得实时、可靠的数据。

提前知道工艺过程pH传感器何时需要更换，或者氧传感器何时需要校准，只要您有需要，就能够获得这些数据。这样传感器才能够真正适应工艺过程环境，为您提供更好的使用安全保障。

可靠的数据对于限度地理解过程至关重要。例如，任何信号干扰都可能隐藏测量的真实值。嘈杂的信号或其他不的信号会降低出现参数死区的可能性。稳定、可靠的数据还可确保不会遗漏任何过程事件，并为批次间或规模间重现性提供最有效的故障排除工具。到目前为止，稳定的数据的好处是能够根据这些数据自动化地控制工艺流程。如果测量信号不可靠，自动化控制就会变得不可靠且风险更高。使用来自两个或多个传感器的数据来计算未进行物理测量的附加参数是一种非常强大的方法，可以进一步了解和优化过程并真正达到PAT合规性。如果进入这些计算的数据不可靠，那么得出的数据就不可能反应真实情况。

在线数据应始终是过程分析的主要目标。PAT指南明确强调了在线测量的好处，那是因为在线测量没有时间延迟，样品条件没有变化（例如，处理过程中的温度或pH变化），并且设置最简单。这使得在线传感成为获得真正代表整个生物反应器的实时数据的方式。

细胞培养监测pH、葡萄糖、细胞密度等关键参数的工作需要对生物反应器中的内容物进行实时测量。生物反应器传感器就为了解决其中一些挑战。培养环境的pH是生物加工中关键的测量值。pH值在许多化学和生物过程中起着重要作用，影响关键代谢途径以及细胞外和细胞内pH，最终影响细胞生长、生产力和产品质量。

细胞自身是无法调节细胞内pH，细胞采用多种机制来控制其细胞内环境，细胞膜是控制细胞内环境的重要选择屏障，细胞外环境可以使用具有低 pH依赖性的有机缓冲系统调节， 所以在细胞培养中对pH的监测就非常重要。

在实验室和中试规模完成一个生物制品生产的细胞培养工艺开发之后，将会开启商业化进程，包括工艺表征、放大、技术转移及生产现场的验证。工艺表征需要进行系统研究以保障商业规模细胞培养，主要包括研究关键操作参数和最终细胞培养性能间的关系，如细胞生长、产量以及终产品的质量属性。因为溶氧、温度、pH、接种密度、营养物质浓度、搅拌剪切力、气体鼓泡等参数能显著影响细胞生长和蛋白质产量，所以在细胞培养工艺缩小模型中将这些参数作为关键参数。培养过程中pH值往往随着培养时间的增加而变化。由于培养物和细胞代谢的变化较其他培养参数变化较为明显，所以工艺表征的主要目的是鉴别关键操作参数及其可接受范围，如：pH的可控范围，鉴别在这个范围内pH对产品质量的影响，从而评价是否会对下游操作及产品质量造成影响。

例如对生产工艺细胞培养工艺的pH表征研究中，对不同培养条件下pH对工艺性能的影响。在检测的pH范围内，和对照相比，细胞生长和产品效价未受到显著影响。然而，最终产品的糖基化亚型水平在高pH条件下有所提高。结果提示细胞培养中pH条件对产品性能参数产生影响，而其他的性能参数不受到影响。参见下图，在六种不同pH设定值下的活细胞密度（a）、存活率（b）、产物表达量（c）和糖基化异构体百分比（d）。

基于生物反应器大小去采取不同的分析测量，会产生一致性和可靠性的问题。选择在线分析测量系统时，不仅应考虑分析系统的性能，还应考虑降低分析风险以及与工艺相关的成本。

为了确保获得的pH测量效果，必须为每个测量点选择合适的在线pH探头。最重要的标准是：过程化学成分、均一性、温度和压力、pH范围和容器尺寸（长度和宽度限制）。对于非水性、低电导率、富含蛋白质以及粘性样品，在线pH探头的选择尤其重要，在线pH传感器是一种设计用于连续测量工业过程中pH的分析仪器。

在生物过程和大多数下游应用的过程开发和放大中，准确确定 pH 值至关重要。在线和离线样品测量之间的生物过程中的 pH 测量偏差可能会发生，这会导致结果的不确定性。